光的吸收
除了在部分或透明的物質(zhì)上發(fā)生折射、散射、干涉和衍射現(xiàn)象外，還可以產(chǎn)生一種顏色印象，如彩虹、蔚藍(lán)的天空、閃閃發(fā)光的肥皂泡、華麗的孔雀羽毛或薄薄的油膜和層，顏色主要通過(guò)光的吸收或反射出現(xiàn)在我們的環(huán)境中。

物質(zhì)的“色彩"是通過(guò)選擇性吸收來(lái)自電磁輻射光譜的可見(jiàn)部分的光而產(chǎn)生的。這個(gè)范圍介于紫外線(xiàn)和紅外光之間。在分子水平上，這意味著分子進(jìn)入電子激發(fā)態(tài)：通過(guò)吸收光量子（光子），電子從占據(jù)的最高分子軌道上移走（HOMO = h最遠(yuǎn) o被占用 m耳目 o比妥;能源 E1）進(jìn)入最di的未占用分子軌道（LUMO= l奧韋斯特 u已占用 m耳目 o比妥;能源 E2）已提出。
 

E光子= h ? υ = (h ? c) / λ = ΔE = E 2 - E 1

E光子：光子的能量
h：普朗克常數(shù)
υ：輻射頻率
c：光速
λ：輻射波長(zhǎng)
ΔE：兩個(gè)能級(jí)之間的能量差

被吸收的光子的能量正好對(duì)應(yīng)于兩個(gè)能級(jí)的能量差，即分子只能以離散的能量狀態(tài)存在，能量被“量子化"，只能以規(guī)定的部分被吸收或釋放。


紫外/可見(jiàn)光譜
可以測(cè)量光的吸收 - 例如在染料溶液中 - 可以測(cè)量。定量紫外/可見(jiàn)光譜的基礎(chǔ)是朗伯-比爾定律：
 

E = lg（I0 / I） = ε ?c ? d

E：吸光度
ε：摩爾消光系數(shù)
c：濃度
d：層厚
我0：樣品前的光強(qiáng)度
I：樣品后的光強(qiáng)度

通過(guò)變換方程，得到化合物的濃度c。

c = E / （ε ? d）

蘭伯特-比爾定律適用于單色輻射。通過(guò)繪制波長(zhǎng)上的吸光度，可以獲得不同波長(zhǎng)的化合物的紫外/可見(jiàn)光譜。

朗伯-比爾定律對(duì)于高濃度溶液以及濃度依賴(lài)性反應(yīng)的發(fā)生（例如 染料的聚集 代表。

當(dāng)穿過(guò)溶液時(shí)，光束變?nèi)?，部分光已被溶液中的分子吸收，即忽略散射和反射? 
 

A + T = 1 = (I0 – I)/ I0 + I/ I0

A = 吸收 = 光的吸收部分 = (I 0 – I) / I 0
T = 透射 = 光的透射部分 = I / I 0

因此適用以下內(nèi)容：

E = -lg (T)

Lambert-Beer 定律中的比例常數(shù)是與波長(zhǎng)相關(guān)的材料常數(shù)，并且描述了允許激發(fā)的所謂躍遷概率。適用光譜選擇規(guī)則，即區(qū)分允許和禁止的躍遷。最重要的選擇規(guī)則是保持多重性（見(jiàn)下文）。允許的躍遷具有更高的躍遷概率，因此具有更高的消光系數(shù)。對(duì)于有機(jī)染料，長(zhǎng)波吸收最大值處的消光系數(shù)值 > 10 5 L mol -1 cm -1；這些是共軛 π 系統(tǒng)中允許的躍遷。

吸收是一個(gè)非?？焖俚倪^(guò)程（10 -15到 10 -14秒），不會(huì)發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)。分子通過(guò)吸收光子吸收的能量在激發(fā)態(tài)的有限壽命后以不同形式再次釋放。如果排除光化學(xué)反應(yīng)，則除了以熱能形式發(fā)射之外，還可能發(fā)生熒光或磷光等發(fā)光現(xiàn)象。這些基本的光物理過(guò)程，其中分子的化學(xué)特性保留在最后，可以用 Jablonski 圖或 Jablonski 項(xiàng)圖的形式圖形表示。



其中緊挨著電子能級(jí) S 0 – S 2和 T 1還顯示了相關(guān)的振動(dòng)子級(jí)別。輻射過(guò)程（波浪線(xiàn)）和非輻射過(guò)程（線(xiàn)）之間的表示有所區(qū)別。

單線(xiàn)態(tài)S只有成對(duì)電子，總自旋為S = 0；三重態(tài) T 有兩個(gè)不成對(duì)的電子，總自旋為 S = 1；這給出了多重性 M = 2 S + 1（存在磁場(chǎng)時(shí)的能級(jí)數(shù)）。 M = 1 for singlet states and M = 3 for triplet states. 因此，多重性守恒的選擇規(guī)則僅允許單線(xiàn)態(tài)或三線(xiàn)態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的轉(zhuǎn)換（“自旋禁止"）。


熒光
熒光（10 -9至 10 -7s) 表示通過(guò)從第一激發(fā)單重態(tài) S 1的振動(dòng)能級(jí)躍遷到 電子基態(tài) S 0的振動(dòng)能級(jí) （即在等多重態(tài)之間）使受激分子失活時(shí)可觀察到的光發(fā)射（“Kasha 規(guī)則"）。因此，觀察到的熒光與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。
 
GG Stokes 在發(fā)光礦物螢石 (CaF 2) 如此命名，可以根據(jù)經(jīng)驗(yàn)與有機(jī)分子的某些結(jié)構(gòu)特征相關(guān)：非芳烴不顯示任何熒光；即使它們有 11 個(gè)共軛雙鍵，如番茄紅素，也不會(huì)，而芳香族化合物幾乎能夠發(fā)出熒光。

因此，在許多（如果不是全部）情況下，剛性和平面分子結(jié)構(gòu)（通常是“芳烴"的情況）可能被視為良好熒光能力的先決條件。
此外，已經(jīng)表明，將某些基團(tuán)引入芳烴會(huì)削弱熒光。其中包括硝基，這意味著例如硝基苯不會(huì)發(fā)出熒光。

 
組合 (ISC)
然而，溴或碘原子也會(huì)降低熒光。然后人們談到了內(nèi)部重原子效應(yīng)。這些取代基通過(guò)更大的自旋軌道耦合促進(jìn)了實(shí)際上自旋禁止的轉(zhuǎn)變?yōu)槿€(xiàn)態(tài)系統(tǒng)。單重態(tài)系統(tǒng)和三重態(tài)系統(tǒng)的等能振動(dòng)能級(jí)之間的這種相互轉(zhuǎn)變被稱(chēng)為“系統(tǒng)間交叉" ( ISC) 。具有不成對(duì)電子的順磁性物質(zhì)，例如分子氧 O 2，也充當(dāng)介導(dǎo)這種轉(zhuǎn)變的催化劑。 三重態(tài) T 1的振動(dòng)基態(tài)失活中的磷光A

 

 在電子基態(tài)S 0的振動(dòng)能級(jí)發(fā)生的光發(fā)射 稱(chēng)為磷光。與只有在激發(fā)時(shí)才能觀察到的熒光不同，磷光也可以在激發(fā)結(jié)束后發(fā)生或持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間（“余輝"）。這又與自旋禁令有關(guān)，導(dǎo)致三線(xiàn)態(tài)的壽命更長(zhǎng)（10 -4到 10 2秒），從而延遲到單線(xiàn)態(tài)基態(tài)的失活。

 
斯托克斯位移
由于熒光或磷光總是來(lái)自電子激發(fā)態(tài) S 1或 T的振動(dòng)基態(tài) v 01發(fā)生時(shí)，與激發(fā)帶相比，發(fā)射帶總是移動(dòng)到更高的波長(zhǎng)，即紅移。與熒光相比，磷光移動(dòng)到更長(zhǎng)的波長(zhǎng)。

 
內(nèi)部轉(zhuǎn)換 (IC)此外，可以發(fā)生稱(chēng)為
“內(nèi)部轉(zhuǎn)換"(IC) 的失活，例如，通過(guò)從第一電子激發(fā)態(tài) S 1的振動(dòng)基態(tài) 到電子基態(tài) S 0的等能電子振動(dòng)能級(jí)的轉(zhuǎn)變 .然后從這種較高的激發(fā)振動(dòng)水平（10 -12s) 放出熱量。這種類(lèi)型的無(wú)輻射失活總是比發(fā)光過(guò)程更快。這個(gè)過(guò)程似乎對(duì)流動(dòng)性很強(qiáng)的分子特別有效。因此，在脂肪族化合物的情況下，人們發(fā)現(xiàn)幾乎是內(nèi)部轉(zhuǎn)變到電子基態(tài)并且沒(méi)有熒光。在大多數(shù)其他分子中，非輻射失活過(guò)程也支配著發(fā)光過(guò)程。

 
熒光染料
只有極少數(shù)有機(jī)染料的非輻射失活速度足夠慢，足以保證激發(fā)態(tài)到基態(tài)的轉(zhuǎn)變，在這種轉(zhuǎn)變中，多余的能量通過(guò)光子的發(fā)射以熒光的形式釋放出來(lái)。
熒光染料的特征在于其光譜特性，例如激發(fā)和發(fā)射光譜、熒光量子產(chǎn)率 (η fl ) 和熒光衰減時(shí)間 (τ fl )。染料的熒光與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)。
選擇染料作為熒光標(biāo)記時(shí)需要考慮的事項(xiàng)在相應(yīng)部分中顯示。

 
光譜特性
熒光染料的光譜特性在很大程度上取決于分子結(jié)構(gòu)。為了使分子的吸收在可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍 (400 - 700 nm) 內(nèi)，基態(tài)和激發(fā)態(tài)之間的能量差必須足夠低。有機(jī)染料最顯著的結(jié)構(gòu)特征是共軛π電子系統(tǒng)，即所謂的“發(fā)色團(tuán)"（希臘色載體）。
在大多數(shù)情況下，染料的熒光光譜在一級(jí)近似下是最長(zhǎng)波長(zhǎng)吸收帶的鏡像，熒光通常移動(dòng) 25 - 40 nm 到更長(zhǎng)的波段。


吸收羅丹明染料
最ATTO-染料，發(fā)色團(tuán)具有剛性分子骨架。許多代表屬于羅丹明染料家族。這些染料的共同結(jié)構(gòu)元素是呫噸骨架中心碳原子上的羧基苯基取代基。
羧基（紅色）位于 2 位或鄰位，顯著影響所有羅丹明的物理化學(xué)性質(zhì)。例如
，由于存在游離的鄰位羧基，ATTO 565和ATTO 590及其衍生物具有在處理這兩種染料時(shí)必須考慮的特殊性質(zhì)。用作熒光標(biāo)記的有ATTO 565和ATTO 590苯基取代基的 4 位或 5 位上的額外羧基：

  

吸收波長(zhǎng)對(duì) pH 值的依賴(lài)性
鄰位羧基的質(zhì)子化-去質(zhì)子化平衡影響羅丹明的光學(xué)性質(zhì)發(fā)色團(tuán)強(qiáng)。染料ATTO 565和ATTO 590



的吸收最大值位置對(duì)于染料的質(zhì)子化和去質(zhì)子化形式是不同的。例如，相對(duì)于質(zhì)子化形式，通過(guò)兩個(gè)羧基的去質(zhì)子化（添加三乙胺），乙醇中ATTO 565的吸收最大值移動(dòng)16 nm 至更短的波（亞光）：



染料-螺內(nèi)酯平衡在平衡狀態(tài)下， ATTO 565和ATTO 590
也 可以形成去質(zhì)子形式的無(wú)色螺內(nèi)酯：在羧酸根陰離子對(duì)中心碳進(jìn)行親核攻擊的過(guò)程中形成五元環(huán)，染料的發(fā)色系統(tǒng)被打斷, 因此形成的化合物不再被可見(jiàn)光吸收并發(fā)出熒光： 螺內(nèi)酯的比例或這種平衡的位置在很大程度上取決于溶劑、pH 值、溫度和染料結(jié)構(gòu)。在極性非質(zhì)子溶劑中，平衡幾乎位于螺內(nèi)酯一側(cè)；在無(wú)水丙酮中是ATTO 565染料的溶液



因此，ATTO 590幾乎是無(wú)色的。另一方面，在水或乙醇等極性質(zhì)子溶劑中，平衡——如上所述——幾乎在有色形式的一側(cè)。
 
熒光光譜在大多數(shù)情況下，染料的熒光光譜是長(zhǎng)波吸收帶的鏡像，這里以ATTO 514
為例可以很好地看出： 熒光最大值通常偏移 25 - 40 nm與吸收最大值相比更長(zhǎng)的波。這種所謂的斯托克斯位移



進(jìn)一步受到激發(fā)態(tài)壽命期間染料周?chē)軇┓肿又匦露ㄏ虻挠绊?，因此發(fā)射發(fā)生在較低能量的“溶劑松弛態(tài)"。激發(fā)期間電子分布變化越大，能量差就越大，因此斯托克斯位移就越大。這在我們的ATTO LS 染料中得到了實(shí)際應(yīng)用。


熒光量子產(chǎn)率 (η fl )
熒光染料最重要的特性之一是熒光量子產(chǎn)率 (η fl )。量子產(chǎn)率描述了發(fā)射光子的比率 (n fl) 到吸收的光子數(shù) (n abs )。

η fl = n fl / n abs

因此，熒光量子產(chǎn)率永遠(yuǎn)不會(huì)超過(guò) 100%。如上所述，非輻射失活過(guò)程經(jīng)常與熒光競(jìng)爭(zhēng)，從而降低量子產(chǎn)率。

高熒光量子產(chǎn)率對(duì)于通過(guò)熒光研究染料當(dāng)然是有利和可取的。我們將在別處更詳細(xì)地探討熒光量子產(chǎn)率
的實(shí)驗(yàn)測(cè)定。熒光衰減時(shí)間 (τ fl )

 

激發(fā)后熒光光子的發(fā)射是一個(gè)統(tǒng)計(jì)過(guò)程。因此，單個(gè)分子保持在激發(fā)態(tài)的時(shí)間也是一個(gè)統(tǒng)計(jì)量。然而，如果考慮許多相同分子的集合，則會(huì)產(chǎn)生明確定義的衰變統(tǒng)計(jì)結(jié)果。在通過(guò)短激光脈沖激發(fā)后，分子數(shù)量在簡(jiǎn)單的情況下呈指數(shù)下降。激發(fā)分子的數(shù)量 (n 1 ) 下降到 1/e 系數(shù)（約 37%）之后的時(shí)間稱(chēng)為熒光衰減時(shí)間 (τ fl )。

n 1 (t) = n 1 (0) exp(- t / τ fl )

熒光衰減時(shí)間是染料的重要特性，可用于識(shí)別染料。我們的ATTO染料的 τ fl值通常在納秒范圍內(nèi)。熒光衰減時(shí)間 的確定在別處描述。分子相互作用 熒光衰減時(shí)間與染料的熒光量子產(chǎn)率一樣，不是一個(gè)固定的量，而是受染料所處環(huán)境（即溶劑和溫度）的影響。染料的衰減時(shí)間和量子產(chǎn)率不是彼此獨(dú)立的，而是通過(guò)以下關(guān)系相互關(guān)聯(lián)的： τ fl







= τ 0 × η fl

τ 0是在沒(méi)有無(wú)輻射失活的情況下發(fā)生的所謂自然衰減時(shí)間(η fl

= 100%)。 因此，熒光衰減時(shí)間的變化可以提供有關(guān)染料分子局部環(huán)境變化的信息。