為 ELISA 試劑盒制備細(xì)胞或組織裂解物

與 RayBio ® ELISA 試劑盒一起使用的細(xì)胞或組織裂解液可以使用大多數(shù)常規(guī)方法來(lái)制備，例如在RayBio® 裂解緩沖液中勻漿細(xì)胞或組織。您還可以使用自己的裂解緩沖液，例如 RIPA 或其他針對(duì)免疫沉淀優(yōu)化的配方。

請(qǐng)注意以下有關(guān)裂解緩沖液成分的指南：

1. 避免使用 >0.1% SDS 或其他強(qiáng)變性洗滌劑。一般來(lái)說(shuō)，非離子型去污劑（如 Triton X-100 或 NP-40）是好的，但兩性離子型去污劑（如 CHAPS）或溫和的離子型去污劑（如脫氧膽酸鈉）也可以。

2. 總洗滌劑用量不超過(guò) 2% v/v

3. 避免使用疊氮hua鈉

4. 避免使用 >10 mM 還原劑，例如二硫蘇糖醇或巰基乙醇

我們強(qiáng)烈建議在均質(zhì)化之前向裂解緩沖液中添加蛋白酶抑制劑混合物。大多數(shù)通用生化供應(yīng)公司（包括 Roche、Sigma-Aldrich、Pierce 和 Calbiochem）都備有多種此類(lèi)產(chǎn)品。由于對(duì)蛋白水解的敏感性和裂解液中存在的蛋白酶類(lèi)型各不相同，因此我們不推薦特定的產(chǎn)品。相反，您選擇使用哪種蛋白酶抑制劑組合應(yīng)基于對(duì)您感興趣的蛋白質(zhì)和/或組織或細(xì)胞類(lèi)型的文獻(xiàn)檢索?？梢允褂昧姿崦敢种苿?，但不是必需的，除非試劑盒中使用的抗體特異性識(shí)別蛋白質(zhì)的磷酸化形式。

裂解和勻漿方法的選擇包括玻璃珠“粉碎"、粉碎、凍融、超聲處理和用研缽和杵粉碎冷凍組織，甚至這些方法的組合。沒(méi)有適用于所有樣本類(lèi)型的最佳方法；您應(yīng)該在簡(jiǎn)要搜索文獻(xiàn)后選擇方法，以了解在以前的調(diào)查中如何準(zhǔn)備與您相似的樣本。

均質(zhì)化后，離心裂解物以去除細(xì)胞/組織碎片（5 分鐘 @ 10,000 xg 或 10 分鐘 @ 5,000 xg）并保存上清液。除非新鮮測(cè)試，否則裂解物應(yīng)盡快冷凍并儲(chǔ)存在 -20°C（或 -80°C，如果可能）下。在進(jìn)行任何免疫測(cè)定孵育之前再次離心。接下來(lái)，使用不受去垢劑抑制的總蛋白測(cè)定（例如二辛可寧酸 (BCA) 測(cè)定）確定裂解物的蛋白質(zhì)濃度，并標(biāo)準(zhǔn)化每個(gè)樣品的體積，以便為每個(gè)測(cè)定提供相同量的總蛋白。

注意：不建議使用 Bradford 測(cè)定法，因?yàn)樗赡軙?huì)因洗滌劑的存在而受到抑制。

由于不同的細(xì)胞和組織可能含有不同量的蛋白質(zhì)，作為起點(diǎn)，我們建議每 1x10 6 個(gè)細(xì)胞或 10 mg 組織使用 500 µL 裂解緩沖液。您可能需要根據(jù)您的結(jié)果進(jìn)行調(diào)整。勻漿的目標(biāo)總蛋白濃度應(yīng)至少為 1,000 µg/mL，但 2,000 µg/mL 或更高會(huì)更好。

無(wú)論您擁有哪種樣品類(lèi)型，強(qiáng)烈建議您在制備后對(duì)所有樣品進(jìn)行分裝，以大程度地減少多次凍融循環(huán)造成的蛋白質(zhì)降解。這也確保了進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的樣品的可用性。