熒光是光致發(fā)光的一種發(fā)光現(xiàn)象。當(dāng)某些物質(zhì)受到光、電、磁、化學(xué)能激發(fā)時,電子吸收能量并從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),激發(fā)態(tài)的電子不穩(wěn)定。它將通過輻射躍遷和非輻射躍遷回到基態(tài)。輻射躍遷的衰變過程伴隨著光子的發(fā)射,產(chǎn)生熒光和磷光。非輻射躍遷包括振動弛豫、內(nèi)部轉(zhuǎn)換和系間跨越。非輻射躍遷會造成能量損失,發(fā)射光子的能量一般小于吸收光子的能量。因此,熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜波長通常大于吸收光譜波長。
1.易于合成和純化,收率高,安全無毒。
2.穩(wěn)定性和溶解性好,特別是脂溶性透膜性好。
3、通過物理化學(xué)作用與標記物質(zhì)特異性結(jié)合,標記條件溫和。殘留物和副產(chǎn)物很容易去除。
4.熒光量子產(chǎn)率高,摩爾消光系數(shù)大,抗漂白能力強。熒光與背景形成鮮明對比。此外。激發(fā)和發(fā)射波長可以有效避免細胞自發(fā)熒光的背景干擾。
1、近紅外光檢測樣品穿透力強、成像分辨率高、檢測靈敏度高、信噪比高。
2.在可見光區(qū)域,生物組織的某些成分會自激發(fā)產(chǎn)生自發(fā)熒光。并且樣品的散射光強度較高,嚴重干擾熒光檢測和成像追蹤。近紅外熒光自發(fā)熒光背景低。
細胞中的RSM往往壽命短、反應(yīng)活性高、濃度極低、對環(huán)境敏感且不發(fā)出熒光。因此,必須借助熒光探針的特異性捕獲標記才能具有近紅外熒光特性。
分子熒光探針廣泛用于研究蛋白質(zhì)和其他生物大分子接觸表面的表面誘導(dǎo)構(gòu)象變化。在直接分析方法中,熒光分析方法應(yīng)用廣泛,且優(yōu)于間接分析方法,因為它不破壞結(jié)合平衡,接近反應(yīng)的真實存在。
熒光納米探針不僅可以作為藥物載體與光敏藥物分子結(jié)合形成多功能納米材料,還可以作為光敏藥物分子的能量供體,提高其單線態(tài)氧產(chǎn)生效率。
光敏劑和熒光染料的吸收光譜、熒光發(fā)射光譜重疊較少。有效避免分子間能量轉(zhuǎn)移引起的熒光猝滅、單線態(tài)氧生成效率降低、熒光成像等。在熒光成像的同時,光敏劑強制激發(fā)產(chǎn)生的單線態(tài)氧也可能與激發(fā)態(tài)發(fā)生光化學(xué)反應(yīng)。熒光探針并引起熒光猝滅?;蛘咚赡軙┞读孔狱c在成像過程中潛在的毒副作用。因此,設(shè)計合適的納米載體結(jié)構(gòu)將光敏劑藥物分子與熒光探針物理隔離是避免此類光化學(xué)反應(yīng)的有效方法。
它選擇性地與物體(分析物)結(jié)合并引起探針所在的化學(xué)或生物微環(huán)境的變化。
識別基團與分析物結(jié)合而引起的化學(xué)或生物微環(huán)境變化,轉(zhuǎn)化為儀器易于感知(顏色變化)或可檢測的信號。
小分子熒光探針一般采用有機小分子熒光團,包括蒽、香dou素、熒光素、BODIPY、萘二甲酰亞胺、羅丹明、花青等。其衍生物的發(fā)射波長范圍幾乎覆蓋所有可見光區(qū)域(400-800 nm)。并且通過對這些熒光團進行適當(dāng)修飾,可以實現(xiàn)藍、綠光到紅光和近紅外光(650-900 nm)的覆蓋。此外,發(fā)光量子點、上轉(zhuǎn)換納米材料、高分子聚合物熒光材料、熒光蛋白等也可作為熒光探針中的信號基團。
連接熒光基團和識別基團,有效地將識別信息轉(zhuǎn)化為熒光信號,如熒光強度的變化、熒光光譜的移動、熒光壽命的變化等。從而實現(xiàn)對治療檢測對象的有效檢測。并非所有探針都有連接基團。
1.質(zhì)子(H+)。
2.自由基和其他活性氮和氧物種(ROS、RNS)。
3.氣體信號分子(NO、CO、H2S……)
4.重金屬污染(Cd2+.Hg2+.Pb2+…)
5.陰離子(Cl-, HCO3-, H2PO4-, HPO42-...)
6.過渡金屬離子(Fe2+/Fe3+, Zn2+, Cu+/Cu2+…)
7.堿金屬和堿土金屬離子(K+、Na+、Ca2+、Mg2+…)
8.DNA、RNA、蛋白質(zhì)等生物大分子。
9、有機小分子如肽、葡萄糖、麥芽糖等。
根據(jù)與客體相互作用后熒光信號的變化,可分為強度變化型熒光探針和比例計型熒光探針。強度變化型熒光探針分為猝滅型(ON-OFF)和增強型(OFF-ON)熒光探針。
強度變化型熒光探針根據(jù)熒光強度的變化實現(xiàn)客體物種的檢測。由于熒光強度還受到探針濃度、激發(fā)光源效率、探針所處環(huán)境等因素的影響,此類探針在客體物種的定量檢測中也存在明顯的局限性。目前,大多數(shù)熒光探針都是增強型熒光探針。
比率熒光探針本身也發(fā)射一定波長的熒光。其明顯的優(yōu)點是可以通過兩個波長下熒光強度的比值來消除大部分環(huán)境因素的干擾,從而實現(xiàn)在探針濃度未知的情況下對被測物種的定量檢測。
傳統(tǒng)的分子探針設(shè)計原理包括光誘導(dǎo)電子轉(zhuǎn)移(PET)、分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)、扭曲分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(TICT)、金屬配體電荷轉(zhuǎn)移(MLCT)、電子能量轉(zhuǎn)移(EET)、熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET) )、激發(fā)態(tài)分子內(nèi)質(zhì)子轉(zhuǎn)移(ESIPT)、激發(fā)態(tài)準分子/激基復(fù)合物形成等。新興機制包括聚集誘導(dǎo)發(fā)射(AIE)、上轉(zhuǎn)換發(fā)光(UCL)等。
一般來說,光致電子轉(zhuǎn)移(PET)工藝分為兩種類型。一種是電子從電子供體轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(電子受體),激發(fā)態(tài)熒光團被還原而引起熒光猝滅。另一種是電子從激發(fā)態(tài)熒光團(電子供體)轉(zhuǎn)移到激發(fā)態(tài)熒光團(電子受體)。電子受體、激發(fā)態(tài)熒光團被氧化導(dǎo)致熒光猝滅。當(dāng)物體未結(jié)合時,熒光團和受體之間的 PET 將淬滅熒光。物體結(jié)合后,PET 過程受到抑制,熒光團發(fā)出熒光。
分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移也稱為光誘導(dǎo)電荷轉(zhuǎn)移(PCT),也是設(shè)計比例熒光探針的重要方法。這類熒光探針的識別基團直接與熒光團相連,也可以理解為組成熒光團的某些原子或基團直接參與客體的識別。
熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)是能量轉(zhuǎn)移(ET)的一種。能量轉(zhuǎn)移是指分子中能量從供體發(fā)色團向受體發(fā)色團轉(zhuǎn)移的過程。 FRET 效率通常通過調(diào)整光譜重疊程度和供體-受體距離來改變。
ESIPT現(xiàn)象是指化合物分子從基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài),然后質(zhì)子通過分子內(nèi)氫鍵轉(zhuǎn)移到分子中相鄰的N、S、O雜原子上,形成相應(yīng)互變異構(gòu)體的過程。
準分子(Er)可以定義為由相同結(jié)構(gòu)的激發(fā)熒光團和基態(tài)熒光團相互作用形成的締合體。同樣,如果處于激發(fā)態(tài)的熒光團和處于基態(tài)的具有不同結(jié)構(gòu)的熒光團形成復(fù)合物,則稱為激發(fā)態(tài)復(fù)合物。