SELEX技術(shù)是指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment,SELEX)。利用該技術(shù),可以從隨機(jī)單鏈核酸序列庫(kù)中篩選出與目標(biāo)物質(zhì)具有高特異性和高親和力的核酸適體(Aptamers)。自Tuerk等人提出以來(lái),SELEX技術(shù)經(jīng)過(guò)十多年的發(fā)展,已成為一種重要的研究方法和工具。
SELEX技術(shù)原理
SELEX技術(shù)的基本思路是在體外化學(xué)合成單鏈寡核苷酸文庫(kù),用其與目標(biāo)物質(zhì)混合,混合物中目標(biāo)物質(zhì)與核酸之間形成復(fù)合物,洗去核酸不與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合,將目標(biāo)物質(zhì)與目標(biāo)物質(zhì)分離。以核酸分子為模板,通過(guò)PCR擴(kuò)增與物質(zhì)結(jié)合的核酸分子,并進(jìn)行下一輪篩選過(guò)程。通過(guò)反復(fù)篩選和擴(kuò)增,一些不與目標(biāo)物質(zhì)結(jié)合或與目標(biāo)物質(zhì)親和力低或中等的DNA或RNA分子被洗掉,而適配體(Adaptor Protein)則是與目標(biāo)物質(zhì)親和力高的DNA或RNA分子。目標(biāo)物質(zhì)。RNA是從一個(gè)非常大的隨機(jī)文庫(kù)中分離出來(lái)的,隨著SELEX過(guò)程的進(jìn)行,純度從p摩爾增加到n摩爾,最終占據(jù)文庫(kù)的大部分(>90%左右)。 SELEX基于分子生物學(xué)技術(shù)合成了單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)。通常文庫(kù)容量為 10 英寸至 10 個(gè)單鏈寡核苷酸序列。文庫(kù)包括DNA文庫(kù)、RNA文庫(kù)和修飾的RNA文庫(kù)。文庫(kù)的中間是隨機(jī)序列,序列長(zhǎng)度往往在20到40bp之間。隨機(jī)序列的兩端是帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的固定序列,是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和其他酶促反應(yīng)相關(guān)引物的結(jié)合位點(diǎn)。在隨機(jī)庫(kù)中,單鏈隨機(jī)寡核苷酸分子很容易形成多種三維結(jié)構(gòu),可以與自然界中幾乎所有種類的分子相互作用。特別是RNA分子容易形成發(fā)夾、假節(jié)、凸起、莖環(huán)、G四聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu),更容易與蛋白質(zhì)、核酸和核酸相互作用。但它在體內(nèi)很容易被核酸酶降解,必須進(jìn)行修飾,如嘧啶環(huán)的2'2F和2'2NH修飾。與RNA相比,DNA的生產(chǎn)成本較低,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,不易被降解。從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出的適配體(Adaptor Protein)更適合體外診斷和體內(nèi)治療。它可以與自然界中幾乎所有類型的分子相互作用。特別是RNA分子容易形成發(fā)夾、假節(jié)、凸起、莖環(huán)、G四聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu),更容易與蛋白質(zhì)、核酸和核酸相互作用。但它在體內(nèi)很容易被核酸酶降解,必須進(jìn)行修飾,如嘧啶環(huán)的2'2F和2'2NH修飾。與RNA相比,DNA的生產(chǎn)成本較低,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,不易被降解。從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出的適配體(Adaptor Protein)更適合體外診斷和體內(nèi)治療。它可以與自然界中幾乎所有類型的分子相互作用。特別是RNA分子容易形成發(fā)夾、假節(jié)、凸起、莖環(huán)、G四聚體等二級(jí)結(jié)構(gòu),更容易與蛋白質(zhì)、核酸和核酸相互作用。但它在體內(nèi)很容易被核酸酶降解,必須進(jìn)行修飾,如嘧啶環(huán)的2'2F和2'2NH修飾。與RNA相比,DNA的生產(chǎn)成本較低,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,不易被降解。從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出的適配體(Adaptor Protein)更適合體外診斷和體內(nèi)治療。核酸和核酸。但它在體內(nèi)很容易被核酸酶降解,必須進(jìn)行修飾,如嘧啶環(huán)的2'2F和2'2NH修飾。與RNA相比,DNA的生產(chǎn)成本較低,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,不易被降解。從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出的適配體(Adaptor Protein)更適合體外診斷和體內(nèi)治療。核酸和核酸。但它在體內(nèi)很容易被核酸酶降解,必須進(jìn)行修飾,如嘧啶環(huán)的2'2F和2'2NH修飾。與RNA相比,DNA的生產(chǎn)成本較低,在體內(nèi)相對(duì)穩(wěn)定,不易被降解。從構(gòu)建的文庫(kù)中篩選出的適配體(Adaptor Protein)更適合體外診斷和體內(nèi)治療。
SELEX技術(shù)特點(diǎn)
(1)庫(kù)容量大,適應(yīng)范圍廣;靶標(biāo)沒(méi)有限制,包括蛋白質(zhì)、核酸、小分子有機(jī)物,甚至金屬離子。
(2)高分辨率。根據(jù)Jenison等人的研究結(jié)果,用茶堿篩選得到的適體與茶堿結(jié)合的解離常數(shù)Kd為0.1mol/L,或在嘌呤環(huán)的N7位上沒(méi)有甲基。
(3)親和力高。以蛋白質(zhì)為目標(biāo)物質(zhì),適配體的解離常數(shù)可以達(dá)到nmol/L的水平,甚至pmol/L的水平。對(duì)于Mr較小的目標(biāo)物質(zhì),解離常數(shù)也可以達(dá)到mol/L—nmol/L的水平。
(4)篩選過(guò)程比較簡(jiǎn)單、快速、經(jīng)濟(jì)。一般情況下,典型的SELEX篩選過(guò)程可在2至3個(gè)月內(nèi)完成,篩選出的適配體的小規(guī)模合成和純化不超過(guò)3天。無(wú)需特殊儀器和試劑,一般實(shí)驗(yàn)室即可完成。篩選抗體至少需要3至6個(gè)月,費(fèi)力且成本高。篩選的自動(dòng)化和規(guī)?;梢詫?shí)現(xiàn)更多、更快、更經(jīng)濟(jì)的適體生產(chǎn)。最近,Men-donsa 等人。報(bào)道稱,當(dāng)SELEX與毛細(xì)管電泳相結(jié)合時(shí),只需幾天的時(shí)間就可以篩選出對(duì)目標(biāo)分子具有高親和力和高特異性的寡核苷酸適配體。
(5)篩選的實(shí)用性。篩選適配體(Adaptor Protein)可定時(shí)、定量、保質(zhì),適配體的變性和復(fù)性快速、可逆、可重復(fù)使用、可在室溫下長(zhǎng)期保存和運(yùn)輸,相對(duì)于抗體和其他蛋白分子具有較強(qiáng)的實(shí)用性。篩選條件可以根據(jù)篩選出的適配體的不同性質(zhì)人為設(shè)定,合成時(shí)可以隨意連接其他官能團(tuán)或分子(如生物素、巰基、甲基),以滿足用戶的需求。需要。
(6)適配體尺寸小。作為藥物施用時(shí),僅產(chǎn)生很低的免疫原性,但具有很強(qiáng)的腫瘤穿透力,并且易于在體內(nèi)清除。